Astratto: L'uso di soluzioni di lavaggio oculare in Giappone, soprattutto nei pazienti con congiuntivite allergica e portatori di lenti a contatto, è andato aumentando. Il nostro scopo era di studiare come l'uso di una soluzione per il lavaggio oculare senza conservanti in occhi sani per un mese influisca sulla sicurezza corneale e sulla mucina della superficie oculare.
Abbiamo analizzato 42 occhi di 21 individui (17 maschi, quattro femmine; età media: 36.1 ± 7.4 anni) senza
allergie oculari, occhi asciutti, o altre malattie oculari attraverso uno studio prospettico. Gli occhi sono stati randomizzati in un gruppo di lavaggio (gruppo uno) e un gruppo di follow-up senza lavaggio (gruppo due). Abbiamo valutato il punteggio relativo alla qualità della vita relativo all'occhio secco (DEQS), tempo di rottura del film lacrimale (TBU), punteggio di colorazione con fluoresceina,Espressione di mRNA di MUC5AC e MUC16, Immunoistochimica MUC16, e MUC5AC acido periodico Schiff (NON) colorazione. Si è verificata una significativa diminuzione dei punteggi DEQS dopo un mese di utilizzo del collirio (p < 0.05). Non ci sono state differenze significative in altri elementi di valutazione che sono stati analizzati (tutto pag > 0.05). inoltre, non sono state osservate differenze significative tra il gruppo uno e il gruppo due in tutti gli endpoint (tutto pag > 0.05). I risultati suggeriscono che l'uso di un mese di una soluzione di lavaggio oculare non conservata non ha effetti dannosi sul film lacrimale e sulle mucine della superficie oculare.
Parole chiave: collirio; mucina; MUC5AC; MUC16
1. introduzione
L'uso di soluzioni di lavaggio oculare in Giappone, soprattutto nei pazienti con congiuntivite allergica e contatto
portatori di lenti, è andato aumentando. Un tipo di tazza lavaggio oculare soluzione, Eyebon® (Kobayashi Pharmaceutical Co., Ltd.; Ōsaka, Giappone) è stato lanciato nel 1995 innescando un ampio riconoscimento delle soluzioni di lavaggio oculare. Nel passato, le soluzioni di lavaggio oculare contenevano conservanti (benzalconio cloruro [BAK]) Fino a 2002. Sono stati segnalati disturbi epiteliali corneali associati all'uso di soluzioni di lavaggio oculare [1]. Attualmente, le soluzioni per il lavaggio oculare senza conservanti sono diventate popolari. Abbiamo già segnalato la sicurezza oculare delle soluzioni di lavaggio oculare non conservate per la congiuntivite allergica [2,3]. inoltre, problemi causati da colliri commerciali, Per esempio, infezione e secchezza oculare, non sono stati ancora segnalati, tuttavia, molti medici sono preoccupati che il lavaggio degli occhi possa alterare la struttura della mucina nel film lacrimale e possa favorire infezioni e cheratocongiuntivite epiteliale.
Secondo le linee guida giapponesi per le malattie congiuntivali allergiche [4], l'uso di soluzioni di lavaggio oculare non è raccomandato a causa del rischio di contaminazione della pelle intorno agli occhi e introduzione di antigeni dalla pelle alla superficie oculare, tuttavia, queste affermazioni non sono state provate. Gli effetti dell'uso di colliri a lungo termine sulla superficie oculare non sono stati finora studiati.
Si ritiene che le mucine della superficie oculare forniscano una barriera per impedire agli agenti patogeni e al particolato di entrare nell'epitelio della superficie oculare e la loro pesante glicosilazione legata all'O mantiene l'idratazione della superficie oculare e la stabilità allo strappo [5]. È stato riportato che quattro sottotipi di mucine secrete (MUC2, MUC5AC, MUC7, e MUC19) e quattro tipi di mucine associate alla membrana (MUC1, MUC4, MUC16, e MUC20) sono espressi sulla superficie oculare [6]. MUC5AC è una mucina gelificante secreta dalle cellule caliciformi congiuntivali ed è espressa principalmente sulla superficie oculare. L'espressione di MUC16 nel glicocalice della superficie oculare aiuta a fornire una barriera protettiva non adesiva per la superficie epiteliale [7]. Abbiamo riportato che i livelli di espressione di MUC5AC sono diminuiti significativamente nelle cellule epiteliali congiuntivali in pazienti con cheratocongiuntivite atopica, una grave malattia congiuntivale allergica, mentre l'espressione MUC16 era sovraregolata [8], tuttavia, gli effetti del collirio sulla mucina e sulla stabilità lacrimale non sono stati completamente compresi e chiariti.
in questo studio, abbiamo studiato l'effetto sulla sicurezza corneale e sulla mucina della superficie oculare (MUC5AC e MUC16) dopo l'uso di una soluzione di lavaggio oculare senza conservanti in occhi sani per un mese
2. Risultati
2.1. Cambiamenti nel punteggio della qualità della vita correlato all'occhio secco (DEQS) Punteggi con l'uso del collirio Il punteggio DEQS medio al basale era 16.0 ± 12.9, e un mese dopo il trattamento col lavaggio oculare lo era 4.6 ± 5.7 nel gruppo uno e 7.9 ± 10.6 nel gruppo due. C'è stata una diminuzione significativa dopo un mese di utilizzo del collirio (p = 0.001), mentre nel secondo gruppo, non c'era alcuna differenza significativa tra il basale e un mese dopo. (p > 0.05) (Figura 1)
Figura 1. Cambiamenti nel punteggio della qualità della vita correlato all'occhio secco (DEQS) punto. Nota il significativo
miglioramento tra prima e dopo 1 mese di utilizzo del collirio (p = 0.001).
2.2. Cambiamenti nei punteggi TBUT e colorazione della superficie oculare
Figura 2 mostra i cambiamenti nel TBUT un mese dopo l'uso del collirio. La media TBUT a
basale non ha mostrato differenze significative tra i gruppi (gruppo uno: 8.07 ± 3.08 S, gruppo due:
7.69 ± 2.14 S; p > 0.05). Allo stesso modo, non c'era alcuna differenza significativa a un mese dopo l'inizio del
trattamento collirio (gruppo uno: 7.76 ± 2.15 S, gruppo due: 7.66 ± 2.30 S; p > 0.05). Nei confronti all'interno dei sottogruppi, non ci sono stati peggioramenti significativi dopo un mese (sia gruppo uno che
gruppo due; p > 0.05)
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Figura 2. Cambiamenti nel tempo di rottura del film lacrimale (TBU). Nota i cambiamenti non significativi di TBUT tra prima e dopo 1 mese di utilizzo del collirio (p > 0.05).
Nessuno degli oggetti presentava alcuna colorazione corneale e congiuntivale prima e dopo un mese di utilizzo del collirio.
2.3. Cambiamenti nei livelli di espressione dell'mRNA MUC5AC e MUC16
Figura 3
mostra i livelli di espressione dell'mRNA MUC5AC e MUC16. Per MUC5AC, non si è verificata una diminuzione significativa del numero di copie/ng di RNA (GAPDH) dalla linea di base (gruppo uno: 0.02 ± 0.03, gruppo due: 0.03 ± 0.05) a un mese dopo l'inizio dell'uso del collirio (gruppo uno: 0.02 ± 0.03 gruppo due: 0.03 ± 0.03) (p > 0.05). inoltre, non è stata osservata alcuna differenza significativa nell'espressione dell'mRNA di MUC5AC tra occhi lavati e non lavati dopo un mese (p > 0.05). Per MUC16, non si è verificata una diminuzione significativa del numero di copie/ng di RNA (GAPDH) dalla linea di base (gruppo uno: 0.29 ± 0.10, gruppo due: 0.31 ± 0.18) a un mese dopo l'inizio dell'uso del collirio (gruppo uno: 0.33 ± 0.19 gruppo due: 0.33 ± 0.24) (p > 0.05). Inoltre, non è stata osservata alcuna differenza significativa nell'espressione dell'mRNA MUC16 tra occhi lavati e non lavati dopo un mese (p > 0.05).
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Figura 3. Cambiamenti nelle espressioni di mRNA MUC5AC e MUC16. Notare il MUC5AC non significativo
e il livello di espressione dell'RNA MUC16 cambia tra prima e dopo 1 mese di utilizzo del collirio (p > 0.05):
(UN) MUC5AC e (B) MUC16.
2.4. Cambiamenti nella colorazione immunoistochimica MUC16
Figura 4 mostra la colorazione immunoistochimica MUC16 rappresentativa prima e dopo l'una
mese di utilizzo del collirio in ciascun gruppo. Colorazione immunoistochimica delle impronte congiuntivali
dagli occhi ha mostrato una colorazione positiva simile per MUC16. I rapporti delle aree colorate con MUC16
gli anticorpi alle aree complessive delle cellule epiteliali congiuntivali non hanno mostrato differenze significative al basale (gruppo uno: 1.5 ± 1.3%, gruppo due: 2.9 ± 3.3%) e un mese dopo l'uso del collirio (gruppo uno: 2.0 ± 1.9 %, gruppo due: 2.3 ± 1.7%) (p > 0.05)(Figura 5)
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.Figura 4. Colorazione immunoistochimica MUC16 rappresentativa. Notare la colorazione positiva MUC16 prima e dopo 1 mese di utilizzo del collirio (frecce rosse): (UN) linea di base nel gruppo uno; (B) dopo 1 mese nel gruppo uno; (C) linea di base nel gruppo due; e (D) dopo 1 mese nel secondo gruppo.
Figura 5. Rapporto tra le aree colorate con anticorpi MUC16 e l'area complessiva del prelievo cellulare. Notare la
la colorazione dell'anticorpo MUC16 non significativa cambia tra prima e dopo 1 mese di utilizzo del collirio
(p > 0.05)
2.5. Cambiamenti della colorazione MUC5AC PAS e della densità delle cellule caliciformi
Figura 6 mostra lo schiff acido periodico MUC5AC rappresentativo (NON) colorazione prima e dopo
un mese di utilizzo di colliri in ciascun gruppo. È stata mostrata la colorazione PAS delle impronte congiuntivali degli occhi
colorazione positiva per numerosi MUC5AC + cellule caliciformi e aree di mucina raccolgono con fogli
di cellule epiteliali congiuntivali sane. Figura 7 mostra i confronti delle cellule caliciformi congiuntivali
densità tra il gruppo uno e il gruppo due al basale (gruppo uno: 14.1 ± 23.6 celle/CV, gruppo due:
18.0 ± 18.7 celle/CV) e un mese dopo il lavaggio oculare (gruppo uno: 15.3 ± 15.0 celle/CV, gruppo due:
18.5 ± 12.6 celle/CV). Non ci sono state differenze significative in relazione sia all'interno del sottogruppo che
variazioni tra i sottogruppi (tutto pag > 0.05
Figura 6. Rappresentante colorazione MUC5AC PAS. Da notare i numerosi MUC5AC + cellule caliciformi prima
e dopo 1 mese di lavaggio oculare (frecce nere): (UN) linea di base nel gruppo uno; (B) dopo 1 mese nel gruppo uno;
(C) linea di base nel gruppo due; e (D) dopo 1 mese nel secondo gruppo
Figura 7. Conteggio delle cellule caliciformi nell'acido periodico di Schiff (NON) colorazione. Nota i cambiamenti non significativi in
conteggio delle cellule caliciformi tra prima e dopo 1 mese di utilizzo del collirio (p > 0.05)
3. Discussione
in questo studio, abbiamo scoperto che una soluzione di lavaggio oculare senza conservanti non ha avuto effetti negativi sugli occhi
mucine di superficie, MUC5AC, e MUC16 e non ha indotto danno epiteliale. Abbiamo in precedenza
ha riferito che il collirio è efficace per la rimozione di allergie e corpi estranei [2]. inoltre,
questo studio mostra che il collirio non altera significativamente la stabilità delle lacrime sulla superficie oculare.
Iwashita et al. hanno riferito che gli occhi con Eyebon® wash avevano fluoresceina e lissamina significativamente inferiori
punteggi di colorazione verde rispetto alla soluzione salina fisiologica contenente BAK [3]. I loro
i risultati hanno indicato che BAK potrebbe aggravare malattie degli occhi come secchezza oculare e puntata superficiale
cheratite (SPK). Perciò, la ricerca sulla secrezione di mucina e sulle cellule che secernono mucina può fornire informazioni preziose e nuove prospettive per la gestione dei disturbi della superficie oculare, compresi gli occhi secchi. L'alterazione delle espressioni di mucina associate alla membrana e la secrezione di mucina gelificante da parte delle cellule caliciformi sono state notate nelle malattie della superficie oculare, inclusa la malattia degli occhi secchi, è un motivo comune e principale per le visite alle cliniche oculistiche. È stato riferito che al 7,4-33,4% della popolazione mondiale è stata diagnosticata la secchezza oculare (560 milioni a 2.54 miliardi di pazienti) [10,11] L'occhio secco è caratterizzato dalla perdita del volume lacrimale, rapida rottura del film lacrimale, ed evaporazione delle lacrime. Si propone che TBUT sia uno dei principali risultati oggettivi nella diagnosi dell'occhio secco, e induce un calo delle prestazioni visive e della qualità ottica [11].
A causa della maggiore incidenza di questa malattia in Asia, i criteri diagnostici dell'occhio secco sono stati rinnovati dall'Asia Dry Eye Society [12].
I criteri rinnovati evidenziano un ruolo essenziale della valutazione della TBUT e hanno definito la TBUT come il fenotipo oggettivo più importante nei pazienti con occhio secco. Sebbene l'anomalia della mucina sia una delle cause della diminuzione del TBUT (film lacrimale instabile) ed è comune, è raramente valutata di routine nella pratica clinica [9]. in questo studio, i pazienti erano relativamente giovani e i pazienti con occhio secco sono stati esclusi. Secondo Farrand et al., la prevalenza dell'occhio secco aumentava con l'età ed era più alta tra le donne rispetto agli uomini [13]. Perciò, In futuro dovrebbero essere chiarite le differenze legate all'età e al sesso in relazione ai cambiamenti della superficie oculare con il lavaggio oculare. Eyebon® contiene condroitina solfato di sodio, che ha un effetto protettivo sulla cornea, e glicirrizinato dipotassico, che ha un effetto antinfiammatorio. Il condroitina solfato di sodio ha anche dimostrato di essere efficace nel trattamento dei difetti epiteliali corneali e della cheratite ulcerosa in modelli animali [14].
Shimazaki-Den et al. ha riferito che i livelli di espressione di MUC5AC nell'epitelio congiuntivale erano significativamente più bassi nei pazienti con occhio secco [15]. Argueso et al.. ha riferito che l'espressione di MUC5AC era significativamente più bassa nel liquido lacrimale e nelle cellule epiteliali congiuntivali nei pazienti con sindrome di Sjögren rispetto agli individui normali [16].
Gli effetti dell'uso di soluzioni di lavaggio oculare negli occhi con tali malattie e bassi livelli di espressione di mucina dovrebbero essere studiati presto. Questo potrebbe fornire informazioni interessanti. Se il microambiente della superficie oculare in tali pazienti è diverso da quello delle persone sane, non si può negare che la mucina sia diminuita. Perciò, in questo studio, intendevamo studiare solo persone sane e poi pazienti con malattie oculari in futuro, tuttavia, ci sono considerazioni etiche in Giappone, e quindi è un problema futuro. Eyebon® viene aggiunto come regolatore del pH perché può essere regolato allo stesso pH della lacrima per prevenire una sensazione di bruciore. Non possiamo negare la possibilità che eccipienti come il polisorbato 80, l-mentolo, e la dl-canfora può anche avere attività di danno epiteliale come BAK, ma non l'abbiamo valutato in questo studio. così, sono necessari ulteriori studi per esaminare se i disturbi epiteliali corneali possono essere causati da eccipienti.
Questo studio non ha mostrato cambiamenti significativi nelle valutazioni oggettive (TBUT e colorazione della superficie oculare) prima e dopo aver lavato gli occhi, mentre la valutazione soggettiva (DEQS) era notevolmente migliorato dopo il lavaggio oculare. Perché l'occhio secco viene diagnosticato da a combinazione di sintomi soggettivi e diminuzione del TBUT [12] in Giappone, i nostri risultati hanno suggerito che la possibilità di esacerbare le condizioni dell'occhio secco con il lavaggio oculare può essere molto bassa, tuttavia, se il punteggio DEQS migliora dopo il lavaggio oculare, non si può escludere la possibilità che ci possa essere un pregiudizio che rende l'occhio non trattato più a disagio. così, per fornire ulteriori indizi in relazione alla funzione lacrimale e ai cambiamenti della superficie oculare, abbiamo anche effettuato analisi citologiche d'impronta. Entrambe le espressioni MUC5AC e MUC16 non hanno avuto cambiamenti significativi dal basale a un mese dopo l'inizio dell'uso del collirio. Nei rapporti tra le aree colorate con anticorpi MUC16 e le aree delle cellule epiteliali congiuntivali, Colorazione PAS delle impronte congiuntivali, e MUC5AC più celle caliciformi, non ci sono state differenze significative tra prima e dopo il lavaggio oculare. In precedenza, abbiamo riportato che le espressioni di mRNA di MUC5AC e la densità delle cellule caliciformi hanno mostrato una drastica riduzione nei pazienti atopici con grave malattia epiteliale [17]. inoltre, sono state trovate molte colorazioni PAS positive per mucine in campioni di citologia da impronta per occhi con malattia epiteliale significativa e ulcere corneali. In contrasto, mucine a cellule non caliciformi (es, MUC1, 2, 4, e 16) Le espressioni di mRNA erano tutte significativamente sovraregolate negli occhi con malattia epiteliale significativa rispetto agli occhi di controllo sani [8]. Perciò, le cellule epiteliali della superficie oculare potrebbero secernere altre mucine per compensare la diminuzione di MUC5AC e per proteggere la superficie oculare. Per questa ragione, è importante valutare la presenza o l'assenza di disturbi epiteliali corneali prima di iniziare l'uso del collirio, e studieremo le mucine diverse da MUC5AC e MUC16 e l'efficacia dell'uso del collirio nei pazienti con dermatite atopica in futuro
Nel trattamento della congiuntivite allergica stagionale (SAC) e congiuntivite allergica perenne (PAC), antistaminici topici, stabilizzatori dei mastociti, antifiammatori non steroidei, e di solito vengono impiegati steroidi, tuttavia, a volte incontriamo pazienti refrattari a questi farmaci. Sebbene possano essere necessari ulteriori steroidi per alleviare i sintomi del paziente, possono causare effetti negativi come la cataratta, infezione, aumento della pressione intraoculare indotto da steroidi (IOP), glaucoma, atrofia cutanea palpebrale, e depigmentazione con alterazioni della barriera [18–20]. Per superare questi problemi, sono stati necessari farmaci terapeutici aggiuntivi o alternativi. Recentemente, collirio è stato utilizzato in pazienti con SAC o PAC. Nel passato, abbiamo riportato che l'effetto antiprurito è durato significativamente fino a 20 min dopo aver lavato gli occhi [2]. Riteniamo che il trattamento con colliri sia efficace principalmente per la reazione in fase iniziale guidata dal rilascio acuto di istamina in quanto contiene un antistaminico, clorfeniramina maleato. inoltre, si prevede che l'effetto del collirio sui sintomi allergici acuti sia dovuto anche alla rimozione meccanica dell'allergene dalla superficie oculare mediante lavaggio, tuttavia, i pazienti tendono a strofinarsi gli occhi dopo questo. Pollinosi cutanea palpebrale (dermatite da polline o blefarite da polline) è stato riportato che suggerisce che l'adesione dei pollini alla pelle palpebrale sottile e morbida induce facilmente allergia cutanea [21,22]. Dal momento che il prurito si verifica nella pelle delle palpebre piuttosto che nel bulbo oculare, l'instillazione oculare potrebbe non essere efficace quanto l'uso del collirio in tali pazienti. Per questi pazienti può essere necessario il trattamento della palpebra [23,24] e le soluzioni per il lavaggio oculare possono essere uno dei metodi per trattare o prevenire il prurito senza reazioni avverse ai farmaci. Anche se questo è stato uno studio di un mese, il collirio può essere utilizzato per un periodo di tempo più lungo nel trattamento della PAC. Inoltre, I portatori di lenti a contatto sono stati esclusi in questo studio, ma dovremmo anche studiare l'efficacia e la sicurezza del collirio nei portatori di lenti a contatto. Perciò, dovremmo considerare uno studio futuro più ampio su questo argomento. I risultati di questo studio hanno suggerito che l'uso di un mese di una soluzione di lavaggio oculare non conservata non ha effetti negativi sul film lacrimale e sulle mucine della superficie oculare.
4. Materiali e metodi 4.1. Disegno dello studio e informazioni sul paziente Questo studio ha aderito ai principi della Dichiarazione di Helsinki. Tutte le procedure sono state eseguite nel rispetto del protocollo (#610) approvato dal comitato di revisione dell'etica istituzionale della Tsurumi University School of Dental Medicine. Il consenso informato scritto è stato ottenuto da tutti i pazienti. Abbiamo eseguito una prospettiva, studio controlateralmente controllato presso l'ambulatorio del Dipartimento di Oftalmologia, Ospedale universitario di Tsurumi. Un totale di 42 occhi dentro 21 individui (17 maschi, 4 femmine; età media: 36.1 ± 7.4 anni) senza allergie oculari, occhi asciutti, o altre malattie oculari sono state analizzate. Gli occhi sono stati randomizzati in un gruppo di lavaggio (gruppo uno, n = 21) e un gruppo di follow-up senza lavaggio (gruppo due, n = 21). I seguenti elementi di valutazione alla baseline e dopo 1 mese sono stati confrontati per analizzare la variazione all'interno del sottogruppo e la variazione tra i sottogruppi; DEQS, film lacrimale MA, punteggio di colorazione con fluoresceina, Espressione di mRNA di MUC5AC e MUC16 nella congiuntiva, Immunoistochimica MUC16 per il rapporto tra le aree colorate e l'area complessiva del prelievo cellulare, e la colorazione MUC5AC PAS per i conteggi della densità delle cellule caliciformi (tavolo 1).
Pazienti che avevano almeno uno dei seguenti 11 le questioni sono state escluse. Pazienti con:
(1) una storia di ipersensibilità allergica o ipersensibilità nota a qualsiasi composto o eccipiente di Eyebon®,
(2) qualsiasi condizione oculare che potrebbe influire sulla loro sicurezza o sui parametri di studio (glaucoma ad angolo stretto che richiede farmaci o trattamento laser, blefarite clinicamente significativa, congiuntivite follicolare, irite, pterigio, o una diagnosi di occhio secco),
(3) una storia di cheratocongiuntivite primaverile o cheratocongiuntivite atopica,
(4) intervento chirurgico oculare il passato 3 mesi prima o chirurgia refrattiva in passato 6 mesi prima dello studio,
(5) una presenza di infezione oculare attiva (batterico, virale, o fungino) o linfoadenopatia preauricolare, o un'infezione erpetica oculare,
(6) qualsiasi malattia sistemica incontrollata,
(7) una storia di stato asmatico, asma persistente moderato o grave, o reazioni asmatiche allergiche da moderate a gravi per studiare gli allergeni,
(8) segni o sintomi manifestati di congiuntivite allergica clinicamente attiva (definita come la presenza di qualsiasi prurito o >1 iperemia nel letto dei vasi congiuntivali) in entrambi gli occhi alla loro prima visita. Pazienti che
(9) sono attualmente incinta, assistenza infermieristica, o pianificare una gravidanza,
(10) indossare lenti a contatto,
(11) hanno usato qualsiasi farmaco (d'attualità, oftalmico topico, sistemico o iniettabile) durante il periodo indicato prima e durante il periodo di studio. Questi includevano l'aspirina, contenente aspirina prodotti, Antistaminici H1-antagonisti (compreso oculare), e tutte le altre terapie antiallergiche, che includono prescrizioni, sul bancone, agenti omeopatici, tutti gli altri preparati oftalmici topici (compresi i sostituti lacrimali) altro che gocce di studio, corticosteroidi o stabilizzatori dei mastociti, e depositi di corticosteroidi.
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4.2. Eyebon®
Eyebon® è una soluzione di lavaggio oculare commerciale utilizzata negli esperimenti sugli animali e negli esami clinici sull'uomo, che può essere utilizzato, fino a sei volte/giorno, sulla base degli standard di approvazione della produzione e della commercializzazione per i prodotti da banco (OTC) droghe. Il lavaggio deve avvenire per ≤30 s per somministrazione sulla base di un rapporto sui disturbi dell'epitelio corneale [1]. In primo luogo, cosmetici e macchie intorno agli occhi sono stati rimossi prima dell'uso. in secondo luogo, la soluzione è stata versata, fino a 5 ml, nella coppetta per il lavaggio oculare allegata, e premuto saldamente sull'occhio. Infine, mentre si preme la tazza sull'occhio, il paziente è rivolto verso l'alto appoggiando la testa all'indietro facendo attenzione a non versare la soluzione, e l'occhio è stato lavato con diversi ammiccamenti. Esistono molti tipi di Eyebon®; abbiamo utilizzato la “Vitamina Eyebon® W”. La soluzione non contiene BAK, ma i seguenti principi attivi (in 100 ml): Glicirrizinato dipotassico 25 mg, clorfeniramina maleato 3 mg, taurina 100 mg, piridossina cloridrato (vitamina B6) 10 mg, cianocobalamina (vitamina B12) 1 mg, e condroitina solfato di sodio 10 mg. Sono inclusi anche i seguenti eccipienti (in 100 ml): acido borico, borace, polisorbato 80, sodio edetato, glicole propilenico, l-mentolo, dl-canfora, e regolatore di pH.
4.3. Questionario
Il punteggio DEQS è un questionario giapponese convalidato specifico per l'occhio secco che è stato utilizzato per valutare i sintomi e i loro effetti sulla qualità della vita (QOL) negli individui giapponesi [25]. Il DEQS è composto da 15 elementi relativi ai sintomi dell'occhio secco e influenza sulla vita quotidiana, e il grado complessivo di compromissione della qualità della qualità è calcolato come punteggio di sintesi da 0 a 100 punti.
4.4. Test di funzione lacrimale e colorazione della superficie oculare
Abbiamo valutato il TBUT e i punteggi della colorazione corneale e congiuntivale con fluoresceina prima e dopo lo studio, come riportato in precedenza [26,27]. Il punteggio TBUT è stato misurato con osservazioni della cornea e della congiuntiva attraverso una lampada a fessura dopo l'instillazione di un 2 µ l di soluzione di fluoresceina nel sacco congiuntivale. È stato misurato il tempo che intercorre tra un battito di ciglia normale e la prima comparsa di una macchia secca nel film lacrimale. La colorazione della superficie oculare con fluoresceina è stata eseguita con un filtro barriera privo di blu. La superficie oculare è stata suddivisa nelle seguenti tre zone: la congiuntiva bulbare nasale, la cornea,
e la congiuntiva bulbare temporale. Il punteggio massimo di colorazione per ciascuna area era 3 punti, e il punteggio massimo di colorazione per la superficie complessiva era 9 punti.
4.5. Citologia dell'impronta congiuntivale
I campioni di citologia da impronta sono stati ottenuti dopo somministrazione di anestesia topica con 0.4% ossibuprocaina. Tre strisce separate di carta da filtro in acetato di cellulosa (Millipore HAWP 304, Bedford, MA, Stati Uniti d'America) che era stato immerso in acqua distillata per alcune ore ed era stato asciugato a temperatura ambiente (25 ◦C) sono stati applicati sul temporale superiore, temporale inferiore, e congiuntiva bulbare nasale inferiore. Queste aree sono state pressate delicatamente da una bacchetta di vetro e quindi rimosse (Figura 8). I campioni sono stati quindi fissati con formaldeide. int. J. Mol. Sci. 2019, 20, x PER LA REVISIONE PARI 9 di 12 4.5. Impressione congiuntivale
Citologia
I campioni di citologia da impronta sono stati ottenuti dopo somministrazione di anestesia topica con 0.4% ossibuprocaina. Tre strisce separate di carta da filtro in acetato di cellulosa (Millipore HAWP 304, Bedford, MA, Stati Uniti d'America) che era stato immerso in acqua distillata per alcune ore ed era stato asciugato a temperatura ambiente (25 ° C) sono stati applicati sul temporale superiore, temporale inferiore, e congiuntiva bulbare nasale inferiore. Queste aree sono state pressate delicatamente da una bacchetta di vetro e quindi rimosse (Figura 8). I campioni sono stati quindi fissati con formaldeide.
I campioni della congiuntiva bulbare temporale superiore erano per PCR di MUC5AC e MUC16. I campioni della congiuntiva bulbare temporale inferiore sono stati assegnati alla colorazione immunoistochimica per confermare la presenza di MUC16. I campioni della congiuntiva bulbare nasale inferiore sono stati colorati con PAS per MUC5A
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Figura 8. Aree di citologia da impronta:
(UN) congiuntiva bulbare superiore per RT-PCR di MUC5AC e MUC16,
(B) congiuntiva bulbare temporale inferiore per immunoistochimica MUC16, e
(C) congiuntiva bulbare nasale inferiore per colorazione MUC5AC PAS. 4.6. La PCR quantitativa in tempo reale per MUC5AC e MUC16 mRNA Expression RNA è stato estratto dai campioni di isogeno. È stata eseguita una qRT-PCR secondo le istruzioni del produttore (Biosistemi applicati, Weiterstadt, Germania). Il cDNA (10 ng) è stato amplificato 30 μL di volume finale in presenza di 1.2 μL degli oligonucleotidi "Assay by Design". (MUC5AC e MUC16 e GAPDH; Biosistemi applicati). Il primer del gene del test e i set di sonde sono stati ottimizzati per la concentrazione, efficienza di amplificazione, e fedele co-amplificazione con un primer gene governante e set di sonde, quest'ultimo compreso GAPDH. È stata allestita una qRT-PCR 96- piastre a pozzetti utilizzando i reagenti sopra e la miscela master TaqMan e come indicato dai dati di ottimizzazione ed è stato eseguito 7000 Termociclatori ABI (Biosistemi applicati). Il profilo termico era costituito da 50 °C per 2 me, 95 °C per 2 me, seguito da 40 cicli di 95 °C per 15 sec e 60 ° C 30 S. I dati in tempo reale sono stati acquisiti e analizzati utilizzando il software del sistema di rilevamento della sequenza (Biosistemi applicati) con regolazione manuale dei parametri di base e soglia. I livelli di espressione dell'mRNA sono stati normalizzati dall'espressione mediana di un gene housekeeping (GAPDH). Le sequenze dei primer per PCR in tempo reale sono mostrate nella tabella 2.
4.7. Colorazione immunoistochimica per MUC16
I campioni di citologia da impronta per la colorazione immunoistochimica MUC16 sono stati collocati in cassette di inclusione fenestrate di plastica (Murazumi, Ōsaka, Giappone). Poi sono stati immersi in vasetti di vetro contenenti 10 mM di tampone citrato di sodio (pH 6.0) e sono stati sottoposti a trattamento a microonde a 500 W per 5 min per attivare l'antigene. I campioni sono stati quindi lavati in soluzione fisiologica tamponata con fosfato (PBS) due volte per 5 me. I campioni sono stati posti su vetrini e bloccati 5 ml PBS con
2 gocce di albumina di siero di cavallo per 20 me. Gli anticorpi monoclonali di topo MUC16 primari a una diluizione di 1:50 (PROGEN Biotechnik GmbH, Heidelberg, Germania) sono stati richiesti 24 h nella stanza Figura 8. Aree di citologia da impronta: (UN) congiuntiva bulbare superiore per RT-PCR di MUC5AC e MUC16, (B) congiuntiva bulbare temporale inferiore per immunoistochimica MUC16, e (C) congiuntiva bulbare nasale inferiore per colorazione MUC5AC PAS. I campioni della congiuntiva bulbare temporale superiore erano per PCR di MUC5AC e MUC16. I campioni della congiuntiva bulbare temporale inferiore sono stati assegnati alla colorazione immunoistochimica per confermare la presenza di MUC16. I campioni della congiuntiva bulbare nasale inferiore sono stati colorati con PAS per MUC5AC, disidratato in gradi ascendenti di etanolo e poi con xilolo, e alla fine il coperchio è scivolato. 4.6. PCR quantitativa in tempo reale per l'espressione di mRNA MUC5AC e MUC16
L'RNA è stato estratto dai campioni di isogeno. È stata eseguita una qRT-PCR secondo le istruzioni del produttore (Biosistemi applicati, Weiterstadt, Germania). Il cDNA (10 ng) è stato amplificato 30 µL di volume finale in presenza di 1.2 µL degli oligonucleotidi "Assay by Design". (MUC5AC e MUC16 e GAPDH; Biosistemi applicati). Il primer del gene del test e i set di sonde sono stati ottimizzati per la concentrazione, efficienza di amplificazione, e fedele co-amplificazione con un primer gene governante e set di sonde, quest'ultimo compreso GAPDH. Una qRT-PCR è stata impostata in piastre da 96 pozzetti utilizzando i reagenti di cui sopra e la miscela master TaqMan e come indicato dai dati di ottimizzazione ed è stata eseguita su 7000 Termociclatori ABI (Biosistemi applicati). Il profilo termico era costituito da 50 ◦C per 2 me, 95 ◦C per 2 me, seguito da 40 cicli di 95 ◦C per 15 sec e 60 ◦C 30 S. I dati in tempo reale sono stati acquisiti e analizzati utilizzando il software del sistema di rilevamento della sequenza (Biosistemi applicati) con regolazione manuale dei parametri di base e soglia. I livelli di espressione dell'mRNA sono stati normalizzati dall'espressione mediana di un gene housekeeping (GAPDH). Le sequenze dei primer per PCR in tempo reale sono mostrate nella Tabella 2 ————————————————————– 4.7. Colorazione immunoistochimica per MUC16
I campioni di citologia da impronta per la colorazione immunoistochimica MUC16 sono stati collocati in cassette di inclusione fenestrate di plastica (Murazumi, Ōsaka, Giappone). Poi sono stati immersi in vasetti di vetro contenenti 10 mM di tampone citrato di sodio (pH 6.0) e sono stati sottoposti a trattamento a microonde a 500 W per 5 min per attivare l'antigene. I campioni sono stati quindi lavati in soluzione fisiologica tamponata con fosfato (PBS) due volte per 5 me. I campioni sono stati posti su vetrini e bloccati 5 ml PBS con 2 gocce di albumina di siero di cavallo per 20 me. Gli anticorpi monoclonali di topo MUC16 primari a una diluizione di 1:50 (PROGEN Biotechnik GmbH, Heidelberg, Germania) sono stati richiesti 24 h a temperatura ambiente (25 ◦C) in una camera umida e quindi i vetrini sono stati risciacquati con PBS 3 volte per 5 me. I campioni sono stati elaborati utilizzando il kit VECTASTAIN ABC (DAKO, co, Carpinteria, circa, Stati Uniti d'America) protocollo (3,30 colorazione diamminobenzidina-perossido). In breve, gli esemplari sono stati sviluppati con 0.025% 3,30 diaminobenzidina (Sigma chimica, co, S. Louis, MO, Stati Uniti d'America) mischiato con 0.3% H2O2, e colorato di contrasto con ematossilina. Disidratazione per immersione in soluzioni successivamente più concentrate di alcol etilico, seguito da immersione in xilene per una notte. Infine, i campioni sono stati trasferiti in bottiglie di vetro e coperti con un mezzo di montaggio per l'esame al microscopio ottico. Anche la valutazione dei campioni al microscopio ottico per la presenza di colorazione immunoistochimica positiva è stata eseguita in modo mascherato
4.8. MUC5AC Schiff acido periodico (NON) Colorazione per i conteggi della densità delle cellule caliciformi
Gli studi quantitativi sulle cellule caliciformi congiuntivali sono stati condotti scattando fotografie utilizzando una griglia calibrata al microscopio ottico con un ingrandimento di 400 ×. Abbiamo fotografato tre aree non sovrapposte di ciascun campione selezionato a caso e fatto la media dei risultati per un punteggio di un singolo campione. I conteggi della densità delle cellule caliciformi sono stati riportati come celle per campo ad alta potenza (GC/HPF). Lo stesso ricercatore abbinato a cui provenivano i campioni ha valutato i campioni per la conta delle cellule caliciformi e la raccolta della mucina. 4.9. Analisi statistica
I dati sono stati analizzati utilizzando il software Prism (ver. 8.1.0 per Mac; GraphPad Software Inc, San Diego, circa, Stati Uniti d'America) ed Excel per Mac (ver. 16.16.11; Microsoft Corporation, Redmond, WA, Stati Uniti d'America). Per confrontare le differenze nei parametri oculari clinici tra i gruppi, è stato utilizzato un t-test accoppiato. Tutti i dati sono stati espressi come media ± deviazione standard (SD). Un valore p < 0.05 è stato considerato un indice di significatività statistica.
Contributi dell'autore: MD. e H.F. ideato e progettato gli esperimenti; MD, COME., e H.F. condotto gli esperimenti; HY, NK, MD, e H.F. analizzato i risultati; HY. e MD. ha scritto il manoscritto; Tutti gli autori hanno letto e approvato il manoscritto finale.
Finanziamento: Questo studio è stato sponsorizzato e finanziato dalla Kobayashi Pharmaceutical Co., Ltd.—Il finanziatore non ha avuto alcun ruolo nella progettazione dello studio; nella collezione, analisi, o interpretazione dei dati; nella stesura del manoscritto, o nella decisione di pubblicare i risultati.
Ringraziamenti: Gli autori ringraziano Editage Company per l'editing in lingua inglese.
Conflitto di interessi: HY, NK, e come. non aveva alcun conflitto di interessi da dichiarare associato a questo manoscritto; MD. e H.F. ha ricevuto un compenso dalla Kobayashi Pharmaceutical Co., Ltd. e Otsuka Pharmaceutical Co.,
Ltd., ma non correlato al consenso dello studio in corso; HF. ha ricevuto un compenso dalla Santen Pharmaceutical Co., Ltd., Senju Pharmaceutical Co., Ltd., Società medica bianca, Ltd., Regeneron Pharmaceuticals Inc., Allergan, e Laboratori Alcon, Inc., ma non correlato al consenso dello studio in corso. Abbreviazioni
Punteggio DEQS sulla qualità della vita relativo all'occhio secco
Congiuntivite allergica perenne PAC
Congiuntivite allergica stagionale SAC
BAK benzalconio cloruro
Pressione intraoculare IOP
Tempo di rottura del film lacrimale TBUT
PAS acido periodico Schif
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